Ngày 2 tháng 5 năm 1568, Mary thoát khỏi Lâu đài Loch Leven với sự giúp đỡ của George Douglas, em trai của Sir William Douglas, chủ tòa lâu đài.[140] Lãnh đạo một đội quân 6000 người, bà giáp chiến với lực lượng mỏng hơn của Moray tại Trận Langside ngày 13 tháng 5.[141] Bị đánh bại, bà trốn xuống phía nam; sau khi qua đêm tại Tu viện Dundrennan, bà vượt qua Solway Firth vào Anh quốc trên một chiếc thuyền đánh cá ngày 16 tháng 5.[142] Bà đổ bộ vào Workington thuộc Cumberland miền Bắc nước Anh và ở lại một đêm tại Lâu đài Workington.[143] Ngày 18 tháng 5, các quan địa phương đón bà và đứa tới Lâu đài Carlisle.[144]

Elizabeth đã tính chuyện giúp Mary giành lại ngai vàng.[145] Elizabeth sau đó thận trọng suy nghĩ lại, phái người điều tra về hành vi của các lãnh chúa và liệu Mary có tham gia giết chồng hay không.[146] Giữa tháng 7 năm 1568, chính quyền Anh chuyển Mary tới Lâu đài Bolton, một nơi hơi xa biên giới Scotland nhưng cũng không quá gần London.[147] Một hội nghị điều tra được tổ chức tại York và sau đó là Westminster giữa tháng 10 năm 1568 và tháng 1 năm 1569.[148] Tại Scotland, những người ủng hộ bà đã tiến hành chiến tranh dân sự chống lại Nhiếp chính Moray và người kế nhiệm ông ta.[149]

Những bức thư trong quan tài

Là Nữ vương đã được xức dầu, Mary Stuart từ chối công nhận quyền hạn của bất kì tòa án nào và từ chối tham gia cuộc điều tra nhằm vào bà tại York (thay vào đó bà gửi đại diện), và Elizabeth cấm bà xuất hiện trong phiên tòa.[150] Như là một bằng chứng chống lại Mary, Moray trình lên cái gọi là bức thư trong quan tài[151]— với 8 mật tự công khai từ Mary gửi đến Bothwell, hai thỏa thuận hôn nhân, và một bài thơ tình đã được tìm thấy trong một chiếc quan tài bạc mạ vàng có diện tích bề mặt nhỏ hơn một bàn chân, dài (30 cm), được trang trí với vài dòng chữ của vua Francis II.[152] Mary không công nhận những văn bản đó, cho rằng chữ viết tay của bà không khó để bắt chước,[153] và khẳng định tất cả là giả mạo.[154] Người ta quan tâm đến việc Mary cảm nhận như thế nào về cái chết của Darnley.[155] Chánh án phiên tòa, Công tước Norfolk, mô tả những dòng chữ là xấu và nguệch ngoạc, và gửi bản sao cho Elizabeth, nói rằng nếu lá thư là thực thì có thể chứng minh được tội lỗi của Mary.[156]

Tính xác thực của những lá thư trong quan tài cho đến nay vẫn là đề tài bàn tán sôi nổi giữa các sử gia. Rất khó để điều tra ngọn ngành sự việc. Bản gốc của những bức thư, viết bằng tiếng Pháp, có lẽ đã bị tiêu hủy vào năm 1584 bởi con trai của Mary.[157] Các bản sao còn sót lại, có cả bản viết bằng tiếng Pháp và bản dịch ra tiếng Anh, đều không hoàn chỉnh. Có thêm những bản sao chép không đầy đủ bằng tiếng Anh, Scotland, Pháp và Latinh trong những năm 1570.[158] Các tài liệu khác xem xét kĩ việc li hôn của Bothwell và Jean Gordon. Moray đã cử sứ giả tới Dunbar vào tháng 9 để lập bản sao các thủ tục tố cáo từ sổ sách của thành phố.[159]

Những người viết tiểu sử cho Mary, bao gồm Antonia Fraser, Alison Weir, và John Guy, đã kết luận rằng các tài liệu trên là giả mạo,[160] hoặc là những đoạn buộc tội được cố tình thêm vào thư,[161] hoặc là những bức thư trên do người khác gửi cho Bothwell và Mary viết cho một người khác.[162] Guy chỉ ra rằng các bức thư khá rời rạc với nhau, và việc sử dụng ngữ pháp tiếng Pháp trong thư khá vụng về, không phù hợp với một người am hiểu tiếng Pháp và sống ở Pháp từ nhỏ như Mary.[163] Tuy nhiên, một số cụm từ nhất định (bao gồm cả câu thơ viết theo phong cách của Ronsard) và một số dấu hiệu khác tương thích với cách hành văn trong các tác phẩm của Mary còn tồn tại đến giờ.[164]

Những lá thư trong quan tài không xuất hiện công khai cho đến Hội nghị năm 1568, mặc dù Hội đồng cơ mật Scotland đã phát hiện ra chúng vào tháng 12 năm 1567.[165] Mary đã bị buộc phải thoái vị và bị giam lỏng trong một năm ở Scotland. Các bức thư không bao giờ được công bố công khai để biện minh cho việc người ta bỏ tù và ép Nữ vương phải thoái vị. Sử gia Jenny Wormald tin rằng sự thực là phía Scotland đã miễn cưỡng tạo ra những bức thư, và tiêu hủy chúng vào năm 1584, bất cứ nội dung trong thư đều là bằng chứng thực sự chống lại Mary,[166] trong khi Weir nghĩ rằng phải mất một thời gian không ít để ngụy tạo những bức thư.[167] Ít nhất cũng có một số người đương thời khi nhìn thấy những bức thư nhưng không nghi ngờ gì và cho chúng là thực. Một trong số đó là Công tước Norfolk,[168] người bí mật lập mưu thành hôn với Mary, mặc dù ông phủ nhân việc này khi Elizabeth nói bóng gió về dự định kết hôn của ông với Mary, nguyên văn là "ông ta không bao giờ kết hôn với một người, nếu ông ta không chắc chắn về gối của ông ta".[169]

Đa số các thành viên trong Hội đồng công nhận rằng bức thư trong quan tài là thật sau khi nghiên cứu về nội dung và so sánh với nét chữ viết tay của Mary.[170] Elizabeth, đúng như mong đợi của bà, đã tổng kết lại cuộc điều tra với một phán quyết là không có bất cứ điều gì được chứng minh, không đủ bằng chứng chống lại các lãnh chúa liên minh hay Mary.[171] Đối mặt với những tình hình chính trị đương thời, Elizabeth không muốn kết tội nhưng cũng không muốn tha bổng tội giết người cho Mary, và bà không bao giờ có ý định can thiệp vào Scotland; Hội nghị trên rốt cục chỉ là một cuộc thử nghiệm chính trị. Cuối cùng, Moray trở về Scotland làm Nhiếp chính, và Mary vẫn bị giam giữ ở Anh. Elizabeth đã thành công trong việc duy trì chính quyền Kháng Cách ở Scotland, mà không kết tội hay phóng thích người em họ của bà.[172] Theo ý kiến của Fraser, đây là một phiên "xét xử" kì lạ trong lịch sử, kết thúc mà không tìm ra được kết luận nào để buộc tội bất kì bên nào khi một bên đã nắm quyền ở Scotland còn bên kia vẫn bị giam giữ.[173]

Âm mưu

Ngày 26 tháng 1 năm 1569, Mary bị dời đến Lâu đài Tutbury[174] và bị đặt dưới sự giám sát của Bá tước Shrewsbury và người vợ đáng sợ của ông ta là Bess xứ Hardwick.[175] Elizabeth coi tư cách kế vị ngai vàng Mary là một mối đe dọa nghiêm trọng và giới hạn bà trong sự giám sát của Shrewsbury, những nơi bà bị giam bao gồm Tutbury, Lâu đài Sheffield, Wingfield Manor và Chatsworth House,[176] tất cả đều nằm sâu trong nội địa nước Anh, giữa Scotland và London, cách xa bờ biển.[177] Mary được phép có người phục vụ, và không bao giờ ít hơn 16 người,[178] và cần 30 cái xe chở đồ đạc của bà từ nơi ở này sang nơi ở khác.[179] Phòng ngủ của bà được trang trí bằng những tấm thảm xinh xắn, đó là vải của nhà nước mà bà thêm lên đó câu tiếng Pháp En ma fin est mon commencement ("Kết thúc của tôi nằm trên khởi đầu của tôi").[180] Tấm lót giương của bà được thay đổi hàng ngày,[181] và đầu bếp riêng của bà chuẩn bị bữa ăn gồm sự lựa chọn 32 món ăn đặt trên một tấm đĩa bạc.[182] Bà thỉnh thoảng được phép đi ra ngoài nhưng bị giám sát nghiêm ngặt,[183] bà dành 7 mùa hạ ở thị trấn có bãi tắm nước khoảng thuộc Buxton, và dành nhiều thời gian cho việc thêu thùa.[184] Sức khỏe của bà ngày càng suy yếu, có lẽ bà đã mắc chứng porphyria hoặc thiếu tập thể dục, và đến những năm 1580, bà mắc bệnh thấp khớp ở chân, và bị què.[185]

Tháng 5 năm 1569, Elizabeth cố gắng hòa giải bằng cách cho Mary phục vị nhưng phải đảm bảo sự tồn tại thế lực Kháng Cách ở Scotland, nhưng một quy ước diễn ra ở Perth từ chối thỏa thuận.[188] Norfolk tiếp tục âm mưu kết hôn với Mary, và Elizabeth giam ông ta vào Tháp London trong thời gian từ tháng 10, 1567 đến tháng 8, 1570.[189] Đầu năm sau, Moray bị ám sát. Cái chết của Moray trùng thời điểm với cuộc nổi dậy ở miền bắc nước Anh, lãnh đạo bởi các Bá tước theo Công giáo, càng khiến Elizabeth tin rằng Mary là một mối đe dọa. Quân đội Anh đã can thiệp vào cuộc nội chiến ở Scotland, hỗ trợ cho lực lượng phản đối Mary.[190] Những bộ trưởng chính như Sir Francis Walsingham và William Cecil, Lãnh chúa Burghley, theo dõi Mary rất cẩn thận và bố trí tai mặt bên cạnh người nhà của bà.[191]

Năm 1571, Cecil và Walsingham khám phá ra Âm mưu Ridolfi, một kế hoạch lật đổ Elizabeth và đưa Mary lên thay, được sự trợ giúp của người Tây Ban Nha và Công tước Norfolk. Norfolk bị hành quyết, và Nghị viện Anh thông qua dự luật loại bỏ Mary khỏi danh sách kế vị, điều mà Elizabeth từ chối chuẩn y.[192] Để làm mất thể diện của Mary, những bức thư trong quan tài được phát tán khắp London.[193] Những âm mưu tôn phù Mary cứ tiếp tục. Giáo hoàng Gregory XIII thừa nhận một kế hoạch vào cuối những năm 1570 nhằm tác hợp bà với Thống đốc của Vùng đất thấp và là anh trai khác mẹ với Philip II của Tây Ban Nha, Don John của Áo, người được cho là đang chuẩn bị cho một cuộc tấn công vào Anh quốc, xuất phát từ Hà Lan thuộc Tây Ban Nha.[194] Sau Âm mưu Throckmorton năm 1583, Walsingham công bố Cam kết hợp tác và Đạo luật về sự an toàn của Nữ vương, theo đó ủng hộ việc giết chết những ai dám chống lại Elizabeth và âm mưu ngăn cản người kế vị giả định nếu bà bị ám sát.[195] Tháng 2 năm 1585, William Parry bị kết án là âm mưu ám sát, điều này Mary không hề hay biết, mặc dù thuộc hạ của bà Thomas Morgan cũng liên can đến vụ này.[196] Vào tháng 4, Mary bị đặt dưới sự giám sát của Sir Amias Paulet,[197] vào Giáng Sinh bà bị chuyển đến nơi giam cầm mới tại Chartley.[198]